Novice - Spremljanje ravni raztopljenega kisika v procesu biofarmacevtske fermentacije

Kaj je raztopljeni kisik?

Raztopljeni kisik (DO) se nanaša na molekularni kisik (O_₂), ki je raztopljen v vodi. Razlikuje se od atomov kisika, prisotnih v molekulah vode (H_₂O), saj obstaja v vodi v obliki neodvisnih molekul kisika, ki izvirajo iz ozračja ali pa jih ustvarjajo vodne rastline s fotosintezo. Na koncentracijo raztopljenega kisika vplivajo različni dejavniki, vključno s temperaturo, slanostjo, pretokom vode in biološkimi aktivnostmi. Kot taka služi kot ključni kazalnik za oceno zdravstvenega stanja in onesnaženosti vodnih okolij.

Raztopljeni kisik igra ključno vlogo pri spodbujanju mikrobnega metabolizma, vpliva na celično dihanje, rast in biosintezo presnovnih produktov. Vendar pa višje ravni raztopljenega kisika niso vedno koristne. Presežek kisika lahko povzroči nadaljnjo presnovo nakopičenih produktov in potencialno povzroči toksične reakcije. Optimalne ravni raztopljenega kisika se razlikujejo med različnimi vrstami bakterij. Na primer, med biosintezo penicilina se raztopljeni kisik običajno vzdržuje pri približno 30 % nasičenosti zraka. Če raztopljeni kisik pade na nič in ostane na tej ravni pet minut, je lahko tvorba produktov znatno oslabljena. Če to stanje traja 20 minut, lahko pride do nepopravljive škode.

Trenutno najpogosteje uporabljeni senzorji raztopljenega kisika lahko merijo le relativno nasičenost zraka in ne absolutne koncentracije raztopljenega kisika. Po sterilizaciji gojišča se izvaja prezračevanje in mešanje, dokler se odčitek senzorja ne stabilizira, nakar se vrednost nastavi na 100 % nasičenost z zrakom. Nadaljnje meritve med procesom fermentacije temeljijo na tej referenci. Absolutnih vrednosti raztopljenega kisika ni mogoče določiti s standardnimi senzorji in zahtevajo naprednejše tehnike, kot je polarografija. Vendar pa so meritve nasičenosti z zrakom običajno zadostne za spremljanje in nadzor procesov fermentacije.

Znotraj fermentorja se lahko ravni RK razlikujejo med različnimi regijami. Tudi ko je na neki točki dosežena stabilna vrednost, se lahko v nekaterih gojiščih še vedno pojavijo nihanja. Večji fermentorji običajno kažejo večje prostorske razlike v ravneh RK, kar lahko pomembno vpliva na rast in produktivnost mikrobov. Eksperimentalni dokazi so pokazali, da je kljub temu, da je povprečna raven RK lahko 30 %, učinkovitost fermentacije v nihajočih pogojih opazno nižja kot v stabilnih pogojih. Zato pri povečanju obsega fermentorjev – poleg upoštevanja geometrijske in močnostne podobnosti – ostaja zmanjšanje prostorskih variacij RK ključni raziskovalni cilj.

Zakaj je spremljanje raztopljenega kisika bistveno pri biofarmacevtski fermentaciji?

1. Za ohranjanje optimalnega rastnega okolja za mikroorganizme ali celice
Industrijska fermentacija običajno vključuje aerobne mikroorganizme, kot sta Escherichia coli in kvasovke, ali sesalske celice, kot so celice jajčnikov kitajskega hrčka (CHO). Te celice delujejo kot "delavci" v fermentacijskem sistemu in za dihanje in presnovno aktivnost potrebujejo kisik. Kisik služi kot terminalni akceptor elektronov pri aerobnem dihanju, kar omogoča proizvodnjo energije v obliki ATP. Nezadostna oskrba s kisikom lahko povzroči zadušitev celic, zaustavitev rasti ali celo celično smrt, kar na koncu povzroči neuspeh fermentacije. Spremljanje ravni raztopljenega kisika zagotavlja, da koncentracije kisika ostanejo v optimalnem območju za trajnostno rast in sposobnost preživetja celic.

2. Zagotoviti učinkovito sintezo ciljnih produktov
Cilj biofarmacevtske fermentacije ni zgolj spodbujanje proliferacije celic, temveč olajšanje učinkovite sinteze želenih ciljnih produktov, kot so inzulin, monoklonska protitelesa, cepiva in encimi. Te biosintetske poti pogosto zahtevajo znaten vnos energije, ki izvira predvsem iz aerobnega dihanja. Poleg tega so številni encimski sistemi, ki sodelujejo pri sintezi produktov, neposredno odvisni od kisika. Pomanjkanje kisika lahko moti ali zmanjša učinkovitost teh poti.

Poleg tega ravni raztopljenega kisika delujejo kot regulativni signal. Tako pretirano visoke kot pretirano nizke koncentracije raztopljenega kisika lahko:
- Spremenijo celične presnovne poti, na primer s prehodom iz aerobnega dihanja v manj učinkovito anaerobno fermentacijo.
- Sprožijo celične stresne odzive, kar vodi do nastajanja neželenih stranskih produktov.
- Vpliv na raven izražanja eksogenih beljakovin.

Z natančnim nadzorom ravni raztopljenega kisika v različnih fazah fermentacije je mogoče usmerjati celični metabolizem k maksimalni sintezi ciljnega produkta, s čimer se doseže fermentacija z visoko gostoto in visokim izkoristkom.

Uvod v diagram pretoka vode za biofarmacevtske izdelke

3. Za preprečevanje pomanjkanja ali presežka kisika
Pomanjkanje kisika (hipoksija) ima lahko resne posledice:
- Rast celic in sinteza produktov prenehata.
- Presnova se premakne na anaerobne poti, kar povzroči kopičenje organskih kislin, kot sta mlečna in ocetna kislina, ki znižujejo pH gojišča in lahko zastrupijo celice.
- Dolgotrajna hipoksija lahko povzroči nepopravljivo škodo, pri čemer je okrevanje nepopolno tudi po ponovni vzpostavitvi oskrbe s kisikom.

Presežek kisika (prenasičenost) predstavlja tudi tveganja:
- Lahko povzroči oksidativni stres in nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS), ki poškodujejo celične membrane in biomolekule.
- Prekomerno prezračevanje in mešanje povečujeta porabo energije in obratovalne stroške, kar vodi do nepotrebnega zapravljanja virov.

4. Kot kritični parameter za spremljanje v realnem času in nadzor povratnih informacij

Raztopljeni kisik (DO) je parameter v realnem času, ki se neprekinjeno in celovito meri in odraža notranje stanje fermentacijskega sistema. Spremembe ravni DO lahko natančno kažejo na različna fiziološka in operativna stanja:
- Hitra rast celic poveča porabo kisika, zaradi česar se raven raztopljenega kisika zniža.
- Izčrpavanje ali zaviranje substrata upočasni metabolizem, kar zmanjša porabo kisika in povzroči zvišanje ravni raztopljenega kisika.
- Kontaminacija s tujimi mikroorganizmi spremeni vzorec porabe kisika, kar vodi do nenormalnih nihanj raztopljenega kisika in služi kot zgodnji opozorilni signal.
- Okvare opreme, kot so odpoved mešala, blokada prezračevalne cevi ali onesnaženje filtra, lahko prav tako povzročijo nenormalno obnašanje raztopljenega kisika.

Z integracijo spremljanja raztopljenega kisika v realnem času v avtomatiziran sistem za nadzor z povratno zanko je mogoče doseči natančno regulacijo ravni raztopljenega kisika z dinamičnimi prilagoditvami naslednjih parametrov:
- Hitrost mešanja: Povečanje hitrosti izboljša stik med plinom in tekočino z razbijanjem mehurčkov, s čimer se izboljša učinkovitost prenosa kisika. To je najpogosteje uporabljena in učinkovita metoda.
- Stopnja prezračevanja: Prilagajanje pretoka ali sestave dovodnega plina (npr. povečanje deleža zraka ali čistega kisika).
- Tlak v rezervoarju: Zvišanje tlaka poveča parcialni tlak kisika in s tem poveča topnost.
- Temperatura: Znižanje temperature poveča topnost kisika v gojišču.

Priporočila izdelkov BOQU za spletno spremljanje biološke fermentacije: